CAPITULO 4 Tecnología de ADN Recombinante

Generalidades de la Tecnología del ADN recombinante

Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas:

Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios:

• Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.
• Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción.

En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas.

En la siguiente link puede verse la animación  "en vivo" la actuación de las enzimas de restricción.

En esta sencilla animación,  tienen dos trozos de ADN de dos especies distintas. Especie A de color rojo y especie B de color azul. Puedes separar las hebras haciendo clic con el ratón y arrastrando. Romperás las hebras como lo hace una enzima de restricción. Después puedes unir las hebras de las dos especies distintas. Es un juego, pero así es como se hace.

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.

En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente.

En esta animación puede verse el desplazamiento de los fragmentos de ADN

Fabricación del DNA recombinante.

El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para la investigación, ya que simplifica la obtención de grandes cantidades de DNA que codifican genes específicos, y facilita las investigaciones de la organización, estructura y expresión génicas. Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria biotecnológica, que está suministrando un número creciente de productos al mercado. El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de segmentos de DNA específicos, incluyendo genes.

Enzimas de restricción.
La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas endo nucleasas de restricción. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por su investigación sobre las enzimas de restricción. Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción diferentes.

La enzima de restricción EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrómica GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros fragmentos de DNA para formar moléculas de DNA recombinante.

Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos de enzimas de restricción:

• Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción. 

• No se utilizan normalmente en la investigación de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso. 

• Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. 

• Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinante puesto que cortan en sitios específicos. 

• Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simétricas (“palindrómicas”), es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección.

Inserción de fragmentos

Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

Figura 1 

Figura 1. En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido. En la figura tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

Figura 2

En la Figura 2, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

La unión del ADN (Figura 3)que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

Figura 3

Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura 4) Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura 5). Así quedará el virus completo(figura 6). En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN.

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Cósmidos. Son plasmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el casmido uniendo los tres elementos ginicos, y el resultado final es poder introducir en la célula receptora fragmentos largos de ADN.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia. 

• Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.
• Genes de luminiscencia. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clón celular que lleve el gen concreto. 

Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente. En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

• Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos. La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. En las siguiente animación puede verse el proceso.

• Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus. 

En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.

  

Los usos del ADN recombinante

A lo largo de los últimos 100 años, el conocimiento de la genética ha crecido exponencialmente. Hoy en día, los científicos se han visto beneficiados con los años de investigación y están explorando con éxito el campo de la ingeniería genética. Combinando el ADN de dos organismos distintos con la técnica del ADN recombinante, son posibles muchos resultados, y el potencial de esta ciencia es virtualmente ilimitado. Los usos del ADN recombinante varían ampliamente; se emplea en muchas industrias diferentes, desde la medicina hasta la agricultura

Artículo: Humberto Ramírez

Fuente:http://www.ehowenespanol.com/usos-del-adn-recombinante-sobre_113734/

Los usos del ADN recombinante

Escrito por Matthew Williams | Traducido por Paula Santa Cruz

Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética

A partir de los años 70 se desarrollaron las herramientas de la biología molecular o la ingeniería genética o lo que se ha llamado técnicas del ADN recombinante. Y esto ocurrió, en comparación con lo que fue el resto de la historia de la ciencia, de forma muy rápida entre los años 70 y 80. 

En estas primeras etapas se estaba trabajando sobre la posibilidad de manipular los genes, es decir: 

A) tenerlos aislados.

B) amplificarlos, en el sentido de tener muchas copias de la misma secuencia.

C) conocer la secuencia exacta, es decir el orden de las bases de esos genes.

D) una vez aislado poderlo expresar fuera de su localización natural, lo cual tendrá una enormidad de otras aplicaciones. 

Toda esta manipulación genética está simplemente basada en unas pocas propiedades del ADN que han permitido avanzar muchísimo en las técnicas. Recordemos: el hecho de que el ADN sea una doble cadena, y las cadenas sean complementarias y que la complementariedad de bases sea un requisito suficiente para que dos cadenas que estaban en simple hebra se encuentren y se vuelvan a reconstituir es la base de la mayor parte de la manipulación. Dos simples cadenas de ADN reconstituyen una doble cadena unida por puentes de hidrógeno basado simplemente en la complementariedad de bases, en el hecho de que si en una de las hebras hay una serie de nucleótidos con las bases GCAT c cualquier otra hebra que tenga CGTA, es decir complementaria, va a poder unirse y reconstituir una doble cadena en determinadas condiciones de temperatura y de pH dadas. 

Esta es una de las características básicas. A esto se agrega el hecho de que el ADN tiene la información en el orden de las bases y que el código por el cual esa información es trascripta y traducida a una proteína es prácticamente universal: ese tramo de ADN si es que codifica para algo puede producir esa proteína en diversas condiciones.

Fuente:uvigen.fcien.edu.uy/utem/herramgen/recomb.pdf