Generalidades
de la tecnología del ADN Recombinante.
El
término DNA recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones
de segmentos o de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera
natural. Aunque el proceso genético de la recombinación produce DNA recombinante,
este término se reserva a las moléculas de DNA producidas por la unión de
segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas. La tecnología del DNA
recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos
nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la
investigación de bacterias y de virus. La utilización del DNA recombinante es
una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias
específicas de DNA a partir de una población de secuencias mezcladas. Los
procedimientos básicos incluyen una serie de pasos:
1.
Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endo nucleasas
de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de DNA por secuencias
nucleotídicas específicas.
2.
Los fragmentos producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se
unen a otras moléculas de DNA que sirven de vectores.
Los
vectores pueden replicarse autónomamente en una
célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula de DNA recombinante recién
creada.
3.
La molécula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de
DNA insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la
molécula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas de copias
idénticas conocidas como “clones”.
4.
Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el DNA
recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas la
secuencia clonada.
5.
Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las células huésped,
purificarse y analizarse.
6.
Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y
el producto génico puede aislarse y examinarse.
El
desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para
la investigación, ya que simplifica la obtención de grandes cantidades de DNA
que codifican genes específicos, y facilita las investigaciones de la
organización, estructura y expresión génicas. Esta metodología también ha dado
un impulso al desarrollo de la naciente industria biotecnológica, que está suministrando
un número creciente de productos al mercado. El DNA recombinante produce
grandes cantidades de copias de segmentos de DNA específicos, incluyendo genes.
Enzimas de restricción.
La
piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipo de enzimas
denominadas endo nucleasas de restricción. Estas enzimas, aisladas en
bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones
víricas degradando el ácido nucleico invasor. Las enzimas de restricción
reconocen una secuencia específica de nucleótidos (denominada sitio de
restricción) de una molécula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa
secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber, Hamilton Smith y
Daniel Nathans por su investigación sobre las enzimas de restricción. Hasta la
fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción
diferentes.
La enzima de restricción EcoRI
reconoce y se une a la secuencia palindrómica GAATTC. El corte del DNA en este
sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. La colas de cadena
sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros
fragmentos de DNA para formar moléculas de DNA recombinante.
Las enzimas de restricción
se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un
sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se
descubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos de enzimas de restricción:
- · Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
- · Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinante puesto que cortan en sitios específicos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simétricas (“palindrómicas”), es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección.
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