PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOTECNOLOGIA ANIMAL

OBJETIVOS DE LA BIOTECNOLOGIA ANIMAL

•  Se pueden generar animales modificados (“animales transgénicos”) para muchos propósitos,que sirvan de modelos a enfermedades humanas o introducir nuevos caracteres a animales importantes en producción como vacas o peces.
• Métodos genéticos como selección asistida por marcadores (MAS) ayuda a identificar zonas en el cromosoma con caracteres importantes como crecimiento
• Los genes se pueden transferir a través de especies, familias e incluso reinos como resultado de tecnología del DNA recombinante.
•  Los principales objetivos de la biotecnología animal son razas que sean más nutritivas y animales económicamente más productivos, incrementen el crecimiento y desarrollo, así como anticuerpos y producción de vacunas

METODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES EN ANIMALES

MICROINYECCION:

 1.    La inyección del gen de interés en un huevo fertilizado de un animal donador

 2. El gen debe ser insertado antes que la primera

 división celular de tal modo que todas las

 células del animal contienen el gen.

TRANSFERENCIA GÉNICA DE CÉLULA MADRE EMBRIONARIA:

1.    (ES) Células indiferenciadas que se dividen para producir células diferenciadas mientras mantienen sus características de indiferenciadas (llamadas células pluripotentes)

2.    Células madre embrionarias “Embryonic stem (ES) cells” se usan para promover reemplazamiento génico dirigido (recombinación homóloga) de manera que el gen se inserta en el cromosoma adecuado.

ANIMALES TRANSGENICOS Y SUS APLICACIONES

    A lo largo de los siglos se han producido animales con nuevas combinaciones de genes, utilizando métodos tradicionales de reproducción mediante cruces selectivos e hibridaciones, pero siempre con la limitación de que los genes que se cruzaban debían pertenecer a la misma especie o a especies muy parecidas. Actualmente, y desde los años 80, la transgénesis ha permitido superar este obstáculo, permitiendo a los científicos la investigación y aplicación de esta técnica en numerosos campos. Además de la obtención de productos valiosos por medio de microorganismos, la ingeniería genética permite la obtención de plantas y animales alterados genéticamente.

    Son lo que se denominan organismos transgénicos, y son aquellos dotados de una nueva información genética derivada de la adquisición de un DNA foráneo y que son capaces de transmitirlo a su descendencia

    Normalmente, en los organismos animales superiores, la información genética se transmite por mecanismos de reproducción sexual en lo que se conoce como transmisión genética vertical; sin embargo, hace alrededor de 20 años, se logró en ratones la transferencia de esta información génica por inyección de un DNA extraño en un cigoto obtenido por fecundación in vitro. Esto último es una transmisión genética horizontal denominada transgénesis. 

   Existen numerosas técnicas que se emplean hoy en día para la obtención de animales transgénicos (virus sin poder patógeno que actúan como vectores genéticos, microproyectiles cargados con DNA, electroporación, microinyección de DNA,…), pero el método más utilizado debido, principalmente, a que permite dirigir las secuencias genéticas a lugares específicos del genoma, es aquel en el que se emplean células en cultivo a las que se somete a modificaciones genéticas específicas, produciendo células madre transgénicas que, posteriormente, son insertadas en embriones en fase de blastocisto.

      Los individuos resultantes portarán el gen sólo en un porcentaje de sus células. A lo largo de los años, se han ido descubriendo nuevas técnicas para el desarrollo de este proceso ya que posee múltiples utilidades y aplicaciones en numerosos campos. Una de las aplicaciones que tiene la transgénesis en animales es la implantación de la hormona del crecimiento para que los animales tengan un crecimiento mayor y más rápido. Así, en el salmón, esta técnica ha conseguido ejemplares que engordan dos veces más rápido y comen menos que las variedades naturales, creciendo incluso en invierno, época en la que normalmente el crecimiento se detiene.

    También se puede utilizar esta terapia para conseguir fortalecer el sistema inmune de determinados animales, haciéndolos incluso resistentes a algunas enfermedades. Existen terneros, por ejemplo, que son resistentes a la mastitis, a la disentería o al cólera, y estas alteraciones a veces pueden transmitirse a la descendencia.

     En el campo de la medicina, también son empleados animales transgénicos con un fin terapéutico, para avanzar en el tratamiento de determinadas enfermedades, para generar medicamentos de forma endógena, o incluso con el objetivo de la realización de trasplantes entre distintas especies (xenotrasplantes). Si se aísla el gen humano causante de una determinada enfermedad y se introduce en ratones, éstos desarrollarán la enfermedad y, así, pueden investigarse nuevos tratamientos sin arriesgar vidas humanas .

   También se emplean en bio-reactores, que son animales a los que se les introduce DNA de ciertos genes humanos capacitándolos así para producir ciertas proteínas humanas que pueden ayudar a tratar determinadas enfermedades. Algunos ejemplos de esta aplicación son vacas, ovejas y cabras cuya leche puede ser usada para tratar la diabetes, el enfisema pulmonar o la hemofilia entre otras enfermedades; el pez Tilapa, que puede producir insulina humana para diabéticos; o cerdos que contienen hemoglobina humana en sus glóbulos rojos.

     En relación a los animales empleados como bio-reactores, es importante destacar que recientemente, en febrero de 2009, la FDA (Food and Drug Administration) ha aprobado el empleo del primer animal transgénico (una cabra) para la producción de la proteína recombinante humana α-antitrombina, una proteína anticoagulante. El objetivo de la producción de esta proteína es el tratamiento de personas con una deficiencia hereditaria de α-antitrombina, ya que estas tienen altos riesgos de sufrir trombos si son sometidos a operaciones o durante el parto.

     

TECNOLOGIA DE ADN RECOMBINANTE

Generalidades de la tecnología del ADN Recombinante.

El término DNA recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso genético de la recombinación produce DNA recombinante, este término se reserva a las moléculas de DNA producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas. La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias y de virus. La utilización del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias específicas de DNA a partir de una población de secuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen una serie de pasos:

1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endo nucleasas de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de DNA por secuencias nucleotídicas específicas.

2. Los fragmentos producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se unen a otras moléculas de DNA que sirven de vectores.

Los vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula de DNA recombinante recién creada.

3. La molécula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la molécula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas conocidas como “clones”.

4. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el DNA recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas la secuencia clonada.

5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse y analizarse.

6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el producto génico puede aislarse y examinarse.

 Fabricación del DNA recombinante.

El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para la investigación, ya que simplifica la obtención de grandes cantidades de DNA que codifican genes específicos, y facilita las investigaciones de la organización, estructura y expresión génicas. Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria biotecnológica, que está suministrando un número creciente de productos al mercado. El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de segmentos de DNA específicos, incluyendo genes.

Enzimas de restricción.

La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas endo nucleasas de restricción. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por su investigación sobre las enzimas de restricción. Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción diferentes.

La enzima de restricción EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrómica GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros fragmentos de DNA para formar moléculas de DNA recombinante.

Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos de enzimas de restricción:

• ·         Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
• ·         Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinante puesto que cortan en sitios específicos.  Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simétricas (“palindrómicas”), es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección.
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Continuacion Capitulo 5: Conceptos y Aplicaciones Basicas en Biotecnologia Vegetal

Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de células animales)
 

Los científicos han desarrollado metodologías para aislar células y obtener poblaciones celulares homogéneas, que luego pueden ser incluso mantenidas y multiplicadas in vitro (“en vidrio” = en recipientes especiales, en el laboratorio). Los cultivos celulares son esenciales en la investigación científica, ya que permiten estudiar los procesos que ocurren en las células, y en diversas aplicaciones de la biotecnología, como la producción de moléculas de interés industrial, ingeniería de tejidos, etc.

¿Cómo se obtienen las células?
 

El primer paso para aislar células de un mismo tipo a partir de un tejido (generalmente formado por células de diversos tipos) consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas 1. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolíticas (como tripsina y colagenasas) que degradan las proteínas de la matriz; y también se utilizan agentes (como el EDTA -ácido etilendiaminotetraacético) que secuestran al ión calcio, del cual depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitación, se obtiene una suspensión celular que contiene a todas las células presentes en ese tejido.
Para separar los diferentes tipos celulares se pueden utilizar varios métodos:
1. La centrifugación, que permite separar a las células por tamaño.
2. La capacidad de adherencia al vidrio o al plástico que tienen algunos tipos celulares.
3. La unión a ciertos anticuerpos específicos para determinados componentes celulares. Estos anticuerpos se usan unidos a diferentes matrices (colágeno, bolitas de polisacáridos, de látex o de plástico). Las células unidas a la matriz (a través de los anticuerpos) se recuperan por agitación, tratamiento con tripsina (digiere a las proteínas que median la adhesión) o, en el caso de una matriz digerible (como el colágeno), degradando la propia matriz con enzimas (como la colagenasa).
4. La unión a ciertos anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes. Las células que contienen un determinado componente son reconocidas y “marcadas” por los anticuerpos. Las células marcadas son separadas de las no marcadas en un separador de células activado por fluorescencia o cell sorter.

5. La disección de un grupo de células a partir de una sección de tejido preparada para microscopía. La región que contiene las células de interés es irradiada con un láser, que funde un pequeño círculo con las células que están por debajo. Estas células capturadas son luego removidas para un posterior análisis. La técnica, denominada “microdisección de captura por láser”, puede utilizarse para aislar y estudiar diferentes partes de un tumor, por ejemplo. Otra técnica relacionada emplea un láser para disectar un grupo de células y “catapultarlas” a un contenedor apropiado para un posterior análisis (Figura 1).
1 La matriz extracelular está compuesta por diferentes tipos de moléculas, entre las que se encuentran los proteoglicanos, polisacáridos como el ácido hialurónico, y proteínas como el colágeno, laminina, fibronectina, fibrina y elastina.

Figura 1. Técnica de microdisección para aislar células a partir de secciones de tejidos. Este método emplea un láser para escindir una región de interés y eyectarla a un contenedor, permitiendo el aislamiento de determinadas células (hasta células individuales) a partir de un tejido (adaptado de Alberts y col., MBC 2002).
 

¿Cómo se cultivan las células?

 
La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. Así, las células pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente, para estudiar los efectos del agregado o remoción de moléculas específicas, como hormonas o factores de crecimiento. Además, se pueden estudiar las interacciones entre células, cultivando en la misma placa más de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos celulares, se los denomina ensayos “in vitro” (“en vidrio”), para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos “in vivo” (“en organismo viviente”)2.
Como se mencionó anteriormente, los cultivos se establecen principalmente a partir de suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos. A diferencia de las bacterias, la mayoría de las células que forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida sobre la cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base de una placa o frasco de plástico, aunque a veces los requerimientos son más complejos y el plástico debe antes recubrirse con componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las células en los tejidos, y con la cual interactúan), como por ejemplo el colágeno y la laminina.
2 En los laboratorios de bioquímica, por in vitro se entienden aquellas reacciones químicas que se llevan a cabo en un tubo de ensayo en ausencia de células, mientras que in vivo se refiere a las reacciones químicas que ocurren dentro de la célula, aún en cultivo.
El cultivo de tejidos y células comenzó en 1907 con un experimento diseñado para esclarecer una controversia en el área de la neurobiología. El investigador Dr. Ross Harrison, quien trabajaba en la Universidad Johns Hopkins, publicó un breve pero crítico artículo (“Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo”) que introdujo exitosamente una nueva técnica, el cultivo de tejidos, para demostrar experimentalmente cómo se originan las fibras nerviosas. Los experimentos originales con fibras nerviosas se basaron en el cultivo de pequeños fragmentos de tejidos, llamados “explantos”. Utilizando técnicas asépticas, Harrison tomó fragmentos del tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema nervioso) de un embrión de rana, y lo depositó en una gota de líquido linfático fresco (“medio de cultivo”) de rana colocada sobre un cubreobjetos estéril. Una vez que la linfa coaguló, invirtió el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que poseía una depresión, creando así un cultivo en gota suspendida, técnica utilizada por los microbiólogos para estudiar las bacterias. Luego de periódicas observaciones al microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas presentes en el tejido extirpado. Así, además de argumentar sólidamente la “doctrina neural”, resolvió los problemas básicos del cultivo celular, como el medio, la observación y la contaminación.

Experimento de Ross Harrison (1907), donde el explanto es la porción de tejido neural, incluido en una gota de linfa. Adaptado de www.corning.com.
 

Cultivos primarios
Se denominan así a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u órgano. Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En estos cultivos las células están vivas, conservan sus características originales y su proliferación es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios.
 

Cultivos secundarios
 

En estas condiciones las células suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una célula de espesor). Como consecuencia del contacto entre las células se detiene temporalmente su proliferación, hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco. Así, podrán subcultivarse durante semanas o meses. En este estadío, las células frecuentemente mostrarán distintas propiedades según su origen. Por ejemplo, los fibroblastos (células que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos animales) secretarán colágeno, las células derivadas de tejido muscular esquelético se fusionarán para generar fibras musculares con capacidad contráctil espontánea, las células nerviosas extenderán prolongaciones (axones) eléctricamente excitables que podrán conectarse (establecer sinapsis) con otras células nerviosas, las células epiteliales formarán largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto (figura 3). Gracias a que estos fenómenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes metodologías, a veces no aplicables a tejidos intactos.

Cultivos continuos o líneas celulares
La mayoría de las células de los vertebrados dejan de dividirse luego de un determinado número de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en cultivo, antes de detenerse. En estas células, así como en muchas otras, la capacidad limitada de proliferación es el resultado de un acortamiento progresivo de los telómeros (porción de ADN que se encuentra en los extremos de los cromosomas). En las células somáticas (todas las células que no son células sexuales) se encuentra “apagado” el gen que codifica para la enzima telomerasa, que se encarga de mantener la integridad de los telómeros; como consecuencia, los telómeros se acortan en cada división celular.
A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que codifica para la telomerasa; así, pueden propagarse como una línea celular “inmortalizada”.
Pero como se mencionó, no todas las células humanas se inmortalizan de la misma manera. Algunas células, a pesar de que sus telómeros permanezcan largos, pueden frenar sus divisiones celulares como consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos de control” (check points) del ciclo celular. Para inmortalizar estas células, hay que lograr la inactivación de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos “oncogenes” (genes promotores del cáncer) que pueden obtenerse de virus que causan cáncer, como algunas cepas del virus del papiloma humano, adenovirus, etc.

A diferencia de las células humanas, las de los roedores no tienen “apagado” el gen de la telomerasa, por lo que sus telómeros mantienen el largo a través de las divisiones celulares. Pero cuando son cultivadas, esas células experimentan cambios genéticos que inactivan los mecanismos de check-point, produciendo líneas celulares inmortalizadas espontáneamente. Ambos tipos de líneas celulares son muy útiles en la investigación celular, como fuente de un gran número de células uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en nitrógeno líquido (a -196 °C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo su viabilidad y siendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de una investigación.
A pesar de la gran similitud que las células de una línea tienen entre sí, no son idénticas. La uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por clonado celular, a través del cual se aísla una sola célula, la que prolifera para formar una colonia de células clonales (idénticas). Una de las aplicaciones más importantes de esta estrategia es el aislamiento de líneas celulares mutantes que poseen defectos en ciertos genes. Su estudio puede servir para inferir el papel que tiene la proteína ausente o alterada en las células normales.
Entre los cultivos celulares más promisorios, desde el punto de vista médico, se encuentran las líneas de células madre embrionarias humanas. Estas células, obtenidas del macizo celular interno de un embrión en los primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar indefinidamente reteniendo la habilidad de originar cualquier tipo celular del cuerpo. Estos cultivos celulares podrían revolucionar la medicina al proveer de células capaces de reemplazar o reparar tejidos dañados. Hay otras fuentes de células madre que se están investigando en tejidos adultos, como la médula ósea y el cordón umbilical.

Los hibridomas

Se sabe que es posible fusionar dos células formando un heterocarionte (o heterocarion), es decir, una célula con dos núcleos separados pero con los contenidos citoplasmáticos compartidos. Para lograrlo, se trata una suspensión de células con compuestos que inducen la fusión de membranas (fusógenos), tales como el polietilenglicol (PEG) o ciertos virus. Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una célula híbrida en la cual las envolturas de ambos núcleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un único gran núcleo. Tales células híbridas pueden clonarse estableciendo una línea celular, pero se sabe que en muchos casos la línea resultante es inestable genéticamente, y tiende a perder parte del material genético.

En 1975, un equipo integrado por el científico argentino César Milstein, desarrolló, mediante la técnica de fusión, una línea celular híbrida clave para la producción de anticuerpos monoclonales (todos iguales) para fines terapéuticos y de diagnóstico: los hibridomas (este desarrollo llevó al Dr. Milstein a ser galardonado con el Premio Nóbel). Los hibridomas son líneas resultantes de la fusión de dos tipos celulares: linfocitos B secretores de inmunoglobulinas (anticuerpos) y células derivadas de una línea tumoral de linfocitos B . De la fusión se obtiene una mezcla heterogénea de células, y con un medio de cultivo especial se seleccionan las células fusionadas que producen anticuerpos y proliferan indefinidamente. Estos hibridomas son propagados como clones individuales, y cada uno de ellos sirve como una fuente estable y permanente de un anticuerpo monoclonal. Dicho anticuerpo reconoce un único epítope antigénico (es decir, una pequeña porción de una proteína). Una de las ventajas de los hibridomas, en comparación con los cultivos clonales de linfocitos B, es que estos últimos tienen una vida limitada en cultivo.

¿Qué contienen los medios para el cultivo de células?
 

Hasta los años ´70, el cultivo de tejidos parecía ser producto de una mezcla de ciencia y alquimia. De a poco, los fluidos coagulados (como en el experimento de Harrison) fueron reemplazados por placas con medios líquidos que contenían pequeñas cantidades de una serie de moléculas necesarias para la supervivencia y multiplicación celular: sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. Además, la mayoría de los medios incluían una mezcla poco definida de macromoléculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios se siguen utilizando en la actualidad para los cultivos de rutina, y por lo tanto es difícil saber qué macromoléculas requiere un determinado tipo celular para funcionar y multiplicarse. Como consecuencia, se desarrollaron numerosos medios químicamente definidos, denominados “libres de suero”, que poseen, además de las pequeñas moléculas mencionadas, varias proteínas específicas necesarias para la supervivencia y proliferación, como los factores de crecimiento. Así, gracias a estudios que buscaban establecer las condiciones mínimas de cultivo para un comportamiento celular adecuado, se descubrieron muchas moléculas de señalización extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y proliferación de determinados tipos celulares.
Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH alrededor de 7,4 y tienen, además, indicadores de pH, como el rojo fenol, que cambian de color a medida que aparecen catabolitos ácidos como resultado del metabolismo celular. Suelen agregarse también antibióticos y antimicóticos para impedir la contaminación con microorganismos.


¿En qué recipientes se cultivan las células?
 

Existen numerosos contenedores y recipientes para cultivar células y tejidos, dependiendo de las características de las células a cultivar y de la escala deseada.
Cuando se cultivan células para hacer experimentos, se hacen cultivos a pequeña escala. En esta escala, las células de multiplican en frascos que tienen una base de 25 a 175 cm2 ( frascos T). En un recipiente típico de 175cm2 pueden obtenerse aproximadamente 1x107 células adheridas, y unas 1x108 células cuando se trata de líneas que crecen en suspensión. En los frascos T estándares no es posible producir cantidades mayores de células, dada la cantidad de tiempo insumida para los
repetidos pasajes necesarios a medio fresco, la demanda de espacio en un incubador (que controla la composición de gases, la temperatura y la humedad del entorno) y el costo de los insumos.
Cuando se necesita aumentar la escala del cultivo (escalado o scaling-up), se deben tener en cuenta numerosos parámetros, incluyendo problemas asociados con la falta de nutrientes, el intercambio gaseoso (especialmente la escasez de oxígeno), y la aparición de metabolitos tóxicos como el amonio y el ácido láctico.
Existen muchos sistemas para escalar los cultivos celulares, que se muestran en la figura 6. Entre ellos, es posible encontrar desde arreglos de frascos triples y botellas cilíndricas, hasta biorreactores más complejos en su estructura. En todos los casos, es necesario asegurar el correcto intercambio gaseoso y la disponibilidad de nutrientes. Por ejemplo, el arreglo de botellas de cultivo sobre rodillos, está diseñado de forma tal que las células cubran toda la superficie interna de la botella, con rodillos que al girar aseguran que el medio de cultivo bañe a todas las células, aportándole nutrientes y retirando desechos. Otro ejemplo es el biorreactor que permite obtener un rendimiento importante de anticuerpos a partir de un cultivo celular.
La adición de bolitas de distintos materiales inertes puede ayudar también a aumentar la densidad celular en cultivos al aumentar la superficie de cultivo entre 10 y 100 veces.

Tipo de contenedores para cultivo de células y sus capacidades

CAPITULO 6: Principios básicos en Biotecnología Animal

BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEJORAMIENTO GENÉTICO DEL GANADO: 

SITUACIÓN ACTUAL Y PERSPECTIVAS

M. Georges

Departamento de Genética, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Lieja 

20 Bd de Colonster, B-4000-Lieja, Bélgica

Resumen: La biotecnología es un elemento cada vez más importante del arsenal de instrumentos que se pueden utilizar para mejorar la producción animal a fin de atender las demandas del consumidor dentro de las limitaciones económicas, ambientales y éticas impuestas por la sociedad. La biotecnología contribuye a la producción animal mejorando los componentes ambientales de los sistemas de producción así como la composición genética del ganado. 

Tras una presentación general de la biotecnología y la producción animal, este texto se centra en tres campos de la biotecnología que contribuyen al mejoramiento genético de los animales, esto es, la biotecnología de la reproducción, la modificación del genoma y la selección mediante marcadores, y la  transgénesis. Una encuesta basada en un cuestionario enviado a los Países Miembros de la OIE nos  permitió resumir brevemente las actividades en curso en esta esfera. El cuestionario también tenía por objeto definir los principales desafíos a los que deberán responder los criadores que se proponen incorporar métodos basados en la biotecnología. Entre los principales problemas que planteará su aplicación futura figuran la desconfianza del público, la falta de recursos financieros para el desarrollo tecnológico en los países en desarrollo y las dudas sobre su rentabilidad. 

1.  INTRODUCCIÓN 

Hace mucho tiempo que la biotecnología forma parte de la cultura humana. La domesticación de las especies vegetales y animales y los procesos de selección artificial que trae aparejados suponen una manipulación de los genes, aún involuntaria. La fabricación de cerveza, quesos y pan, que se basa en el dominio de la fermentación utilizando una variedad de microorganismos, es tan antigua como la historia de la humanidad. 

Con el advenimiento del ADN recombinante, empero, el poder de la biotecnología se ha incrementado de modo espectacular, y ha estimulado la imaginación de los científicos y los legos por igual. Las aplicaciones de la biotecnología están prosperando sobre todo en los ámbitos de la salud humana y la agricultura. No obstante, en los foros científicos y públicos han cobrado una importancia creciente las preocupaciones vinculadas a los posibles riesgos y a la ética, que han dado lugar a veces a moratorias decretadas por la propia comunidad científica o impuestas por el poder legislativo. 

2.  BIOTECNOLOGÍA Y PRODUCCIÓN ANIMAL 

El desafío que se plantea para la producción animal consiste en proporcionar a la sociedad productos alimenticios que satisfagan sus cambiantes necesidades de nutrición, dentro de límites económicos y ambientales específicos. Sobre la base del principio fundamental  “F = G + A” (es decir que el fenotipo de un animal refleja su aptitud genética intrínseca o genotipo tal como se expresa en un medio ambiente determinado), los criadores de animales han adoptado un enfoque doble para mejorar la calidad de su producción. Por un lado, han aprendido a dominar los componentes ambientales perfeccionando las prácticas de cría y alimentación de los animales, la profilaxis y el tratamiento de las enfermedades. Por el otro, la selección artificial ha permitido obtener continuas mejoras de la composición genética de las especies domésticas. La aplicación de complejos métodos biométricos en los programas de reproducción ha generado progresos genéticos espectaculares durante la segunda mitad de este siglo. 

                                     

La biotecnología se ha integrado al arsenal de herramientas destinadas a mejorar los componentes ambientales (A) y naturales (G) de la ecuación. Las aplicaciones de la biotecnología destinadas a mejorar los  componentes ambientales, recientemente analizadas por Robinson y McEvoy (1993), incluyen: 

- las manipulaciones genéticas de las especies de forraje, para acrecentar su productividad o su valor nutritivo,

- las manipulaciones genéticas de microorganismos a fin de producir aditivos alimenticios,

- las manipulaciones genéticas de la microflora intestinal,

- la producción de compuestos terapéuticos o profilácticos - comprendidas las vacunas - a partir de  Microorganismos genéticamente modificados,

- la producción de hormonas o análogos hormonales a partir de microorganismos genéticamente tratados,

- la inmunorregulación de los procesos fisiológicos,

- el mejoramiento de los métodos de diagnóstico basados en el ADN. 

El presente informe se propone centrarse en las actividades actuales de aplicación de la biotecnología moderna a los componentes genéticos de la ecuación, con el fin de mejorar con mayor eficacia la composición genética de las especies domésticas. 

3.  BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEJORAMIENTO GENÉTICO DEL GANADO 

3.1. Presentación general 

Las técnicas de reproducción recurren a la selección de los animales genéticamente superiores como  progenitores de las generaciones subsiguientes. Por consiguiente, en este nivel la selección artificial sólo se  podría aplicar a rasgos que revelan una variación genética "natural" en las poblaciones seleccionadas, esto es, rasgos caracterizados por algún grado de heredabilidad. El índice de progreso genético o de respuesta a la selección depende de: 

- la exactitud de la selección,  esto es, la precisión en la identificación de los animales genéticamente superiores; 

- el intervalo entre generaciones: cuanto más breve es el intervalo, más rápidos son los progresos

genéticos; 

- la intensidad de la selección, es decir que cuanto más se aparten los futuros animales reproductores del

Valor medio de sus contemporáneos, mayor será el mejoramiento genético. 

La biotecnología se está aplicando para acelerar los progresos genéticos sobre la base de los cuatro factores siguientes: aumentar la variación genética (o el sustrato molecular de los programas de reproducción), aumentar la exactitud de la selección, reducir el intervalo entre generaciones e incrementar la intensidad de la selección. 

Se pueden distinguir tres campos fundamentales en la biotecnología aplicada al mejoramiento genético del ganado: 

- las técnicas de reproducción,

- la manipulación del genoma y la selección mediante marcadores (SMM), y

- la transgénesis aplicada a los animales de cría. 

En el siguiente cuadro se sintetizan las repercusiones posibles de estos tres campos de investigación sobre los cuatro componentes que determinan el índice de progreso genético. 

Cuadro 1

 Variación  genética

Exactitud de la  selección

Intervalo entre generaciones 

- 22 - 

Intensidad de la selección 

Reproducción

+ ++ ++ +

Modificación del  genoma y SMM 

+ + + ++ 

Transgénesis

++   

3.2. Biotecnología de la reproducción 

Se han elaborado o están en estudio una serie de métodos destinados a aumentar el potencial reproductivo del ganado (2, 8, 9, 10), entre ellos los siguientes: 

- Inseminación artificial (IA): Sobre todo desde la elaboración de métodos eficaces de congelación del semen la IA ha pasado a ser la biotecnología más difundida en la producción animal, en particular de bovinos. Al permitir la utilización en gran escala de un pequeño número de reproductores de élite, la IA ha tenido repercusiones espectaculares en la intensidad de la selección. Además, ha facilitado la ejecución del programa de evaluación de la descendencia aplicado principalmente a las razas bovinas lecheras, y ha contribuido notablemente al mejoramiento del ganado al aumentar la exactitud de la selección pese a la prolongación conexa del intervalo entre generaciones.  

- Ovulación múltiple y transferencia de embriones (OMTE): Al multiplicar la descendencia, sobre todo en  especies que presentan pocas variaciones, la OMTE ofrece posibilidades para acentuar el mejoramiento genético aumentando la intensidad de la selección de las hembras. En el ganado bovino, empero – la especie en la que más difundida está esta tecnología - el principal efecto de la OMTE podría deberse a la reducción del intervalo entre generaciones, en comparación con el programa clásico de evaluación de la descendencia, si los reproductores se seleccionan sobre la base de los resultados de sus dobles hermanas producidas por OMTE antes que en los resultados de su descendencia hembra: es el llamado esquema de los núcleos de selección de la OMTE. Pese a las dificultades técnicas que plantea, la OMTE podría llegar a desempeñar un papel importante en los países en desarrollo, donde sería difícil poner en práctica la aplicación en gran escala de un programa de evaluación de la descendencia basado en la inseminación artificial. 

- Recolección de ocitos (RO), maduración de ocitos in vitro (MIV), fecundación in vitro (FIV): El número de embriones que se pueden obtener por año de una vaca utilizando la OMTE se limita en promedio a unos 20 o menos, mientras que la combinación de RO con MIV y FIV permite multiplicar ese número al menos por 5. Es más, la recolección de embriones se puede aplicar a vacas preñadas tanto como a animales prepuberales. El efecto de estas metodologías sobre la respuesta genética se produce por las mismas vías que la OMTE, es decir, un aumento de la intensidad de la selección de las hembras y una mayor exactitud de la selección tanto de machos como de hembras. 

- Transferencia de núcleos o clonación de embriones: La transferencia de núcleos toti potentes a ovocitos enucleados permite teóricamente producir grandes números de gemelos idénticos o "clonos". Los principios que rigen la clonación de embriones se resumen en la Figura 1

. Esta metodología abre la posibilidad de afectar la respuesta genética de muy distintas maneras, entre ellas la intensidad y la exactitud de la selección y el intervalo entre generaciones. Inicialmente, la fuente de núcleos totipotentes eran las blastómeras. Pese a la posible utilización de blastocitos de la primera generación y de generaciones ulteriores como donadores de núcleos, la dimensión de los clonos ha seguido siendo muy pequeña. La reciente generación de células madres embrionarias totipotentes (de tipo “ES”) en ovinos, a la que seguirán probablemente adelantos similares en otras especies, podría acrecentar considerablemente la eficiencia de la clonación de embriones (3). 

- Selección del sexo: Recientes adelantos en la clasificación por cartometría de flujo permiten ahora separar eficazmente los espermatozoides viables portadores de un cromosoma X o Y. Aunque las cantidades de células recuperadas son incompatibles con las prácticas tradicionales de inseminación artificial, son suficientes cuando se combinan con técnicas de FIV. Este podría llegar a ser el método predilecto para  generar embriones del sexo deseado. La selección del sexo de los embriones también se puede lograr por microbiopsia y determinación del sexo utilizando secuencias Y específicas amplificadas mediante la técnica de reacción de polimerización en cadena (PCR). Este método, empero, sólo se justifica muy excepcionalmente desde el punto de vista económico. 

- Criopreservación de gametos y embriones: La mayoría de los métodos conocidos sólo son eficaces si se los utiliza en combinación con métodos de congelación de gametos y embriones. Además, la

Crio preservación desempeña un papel esencial en los programas de conservación destinados a preservar la diversidad genética. 

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Figura 1 

EMBRIÓN DONANTE

OOCITO RECEPTOR

AISLAMIENTO DEL

BLASTÓMERO

CLONAJE MULTIGENERACIONAL

3.3. Estudio del genoma y selección mediante marcadores (SMM) 

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ENUCLEACIÓN

ELECTROFUSIÓN

CLONAJE

EMBRIONARIO

Los adelantos de la genética molecular, impulsados por la Iniciativa del Genoma Humano, permiten ahora desarrollar cantidades ilimitadas de marcadores genéticos, el instrumento fundamental del especialista en  genética. Estos marcadores se pueden utilizar para localizar genes determinantes de rasgos fenotípicos en los mapas genómicos correspondientes aplicando estrategias de enlace genético. Este enfoque cartográfico es el primer paso en el proceso denominado clonación posicional que culmina con la identificación del gen causante y la mutación (5).  

Por primera vez, estos métodos permiten descomponer los rasgos de producción en sus componentes o genes mendelianos individuales. El Cuadro 2 presenta la lista los caracteres monogénicos correspondientes a un solo gene que se han podido localizar en los animales de renta mediante el uso de esta técnica. Para los caracteres poligénicos, a los que pertenece la mayoría de los rasgos de producción, estos genes se denominan loci cuantitativos o Quantitative Trait Loci (QTL). Experimentos recientes en los que se estudiaban las características del crecimiento y de las canales porcinas, así como la producción de leche en los bovinos, han demostrado de  manera convincente la factibilidad de este enfoque basado en la cartografía de los QTL en los animales de cría (1, 6).  encontrado el 02 de noviembre en : 

M. Georges BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEJORAMIENTO GENÉTICO DEL GANADO: SITUACIÓN ACTUAL Y PERSPECTIVAS Departamento de Genética, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Lieja 20 Bd de Colonster, B-4000-Lieja, Bélgica http://www.oie.int/doc/ged/d3010.pdf

Bibliográfica sugeridas

Bisang, R., Campi, M., Cesa, V., (2009), Biotecnología y desarrollo, Comisión Económica para América Latina y el Caribe (CEPAL), Buenos Aires encontrado en  www.cepal.org/publicaciones/xml/9/35729/docw35.pdf

CAPITULO 5: Conceptos y Aplicaciones básicas en Biotecnología Vegetal

Los cultivos celulares y sus aplicaciones II (cultivos de células vegetales)

El término genérico “cultivo de tejidos vegetales” involucra a diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales).
Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).

Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones, algunas de ellas se ilustran en la Figura 1:
• Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción
• Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año
• Obtención de plantas libres de virus
• Producción de semillas sintéticas
• Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad genética de una población vegetal)
• Obtención de metabolitos secundarios
• Producción de nuevos híbridos
• Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de plantas transgénicas)
• Germinación de semillas.
• Producción de haploides.
• Estudios fisiológicos diversos.

Figura 1. Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. A la izquierda, micropropagación de violeta africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad. A la derecha, semillas sintéticas formadas por embriones somáticos obtenidos por cultivo de células, encapsulados en una matriz inerte (como el alginato de calcio). Fotografía tomada de http://www.sp.edu.sg/schools/cls/bioline_08.htm

Las bases biológicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad celular

La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, varias células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametas. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en los distintos órganos de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.) para

generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. Las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:

• una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión, pero que no se originaron por unión de gametas),

• una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos).

La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa.

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denominará explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas.

La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada es la composición del medio de cultivo.

No existen dudas que en todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y que está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.

La totipotencialidad celular es clave en el desarrollo de plantas genéticamente modificadas o transgénicas. Una vez realizada la transformación, ya sea por Agrobacterium o por el método de biobalística, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de obtener, a partir del explanto inicial transformado, plántulas que lleven el transgén en todas sus células (Figura 2).

Figura 2. Cultivo de tejidos y transformación vegetal. En la figura se observan explantos que, luego del proceso de selección, han perdido coloración y aquellas células transformadas exitosamente que se han desdiferenciado y rediferenciado para dar origen a un brote.

Pasos necesarios para generar plantas a partir de explantos aislados

 

En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro se pueden distinguir las siguientes etapas (sintetizadas en la Figura 3):

1) Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.

2) Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee.

3) Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.

4) Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.

5) Rusticación, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte)

El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones ambientales.

Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material en tierra.

Figura 3. Etapas de la regeneración in vitro del maíz. Imágenes tomadas de http://www.cid.csic.es/departaments/genetica/torne/indexC.html y http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e28_2/maize.html

Elementos necesarios para el cultivo de tejidos vegetales

Para llevar adelante este trabajo, se necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así

que se desea trabajar (Figura 4). Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o líquido, y que está conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales (ver Tabla 1) que ayudarán a obtener una planta o un órgano en particular, a partir del explanto elegido. Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas en su composición (jugo de tomate, agua de coco, etc.), que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas suele variar entre pH=5 y 6,5. Luego se regulan las condiciones de temperatura y de

a la muestra con la fotoperíodo (relación de horas luz y horas oscuridad).

 Figura 4. Flujo laminar para el cultivo de tejidos. Se observa uno de los modelos de flujo laminar que puede usarse para preservar la esterilidad de las muestras. Imagen tomada de

www.jaelsa.com/laboratorio4.html.

Según sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo, se puede propiciar la regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales. Por ej., si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor que 1, se favorece la generación de brotes; si es menor que 1, la generación de raíces; y si es igual a 1, la formación de callos.

 

Tabla 1. Composición de medios de cultivo para células vegetales

El cultivo in vitro y la biotecnología:

• La micropropagación

La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos de importancia económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son realizados por personal especializado en medios específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz) (Figura 5). Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a mayor escala de producción.

La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura, ya que se la usa en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.

Figura 5. La micropropagación vegetal. A partir de una planta madre se obtienen numerosos explantos que, sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darán lugar a nuevas plantas iguales a la planta original, permitiendo su multiplicación.

Entre las ventajas de la micropropagación se pueden mencionar:

- Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.

- Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su independencia de los mismos (luz, temperatura y humedad controlada).

- Permite estudiar diversos procesos fisiológicos.

- Evita el riesgo de contaminación con patógenos, ya que se realiza en medios esterilizados.

- Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.

- Permite la obtención de individuos uniformes.

- Facilita el transporte del material.

• El cultivo de meristemas

En la yema apical se encuentran un grupo de células que conforman el meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A partir de ellos se pueden regenerar plantas completas (Figura 6).

Figura 6. Cultivo de meristemas. A partir de un meristema aislado se puede obtener una planta completa. Adaptado de Biotecnología, UNQ 2006.

El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no es afectada por estos patógenos vegetales. Otra muy importante es la multiplicación vegetal. La potencialidad de la técnica se demuestra con un ejemplo: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4.000.000 de claveles en un año. La técnica permite también multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas), o acelerar la producción de plantas bianuales.

• Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores

Una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una suspensión de células. Esta suspensión puede utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las semillas sintéticas), o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que son compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, y algunos edulcorantes. Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad (de unos pocos a miles de litros), diseñados para propiciar el crecimiento y/o la multiplicación de distintos tipos de células y/o órganos (Figura 7).

Las raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores, especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que produce un aumento abrupto en el tamaño y ramificación de la raíz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad del producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico producido por cultivo de raíces es el paclitaxel, o taxol, que es utilizado como anticancerígeno.

Figura 7. Cultivo de células y órganos vegetales. A partir de un explanto se pueden establecer cultivos de células para producir compuestos de interés, o para obtener embriones somáticos y semillas artificiales, entre otras aplicaciones. Adaptado de “Biotecnología”, UNQ 2006